采用表面張力、界面張力、熒光、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和冷凍刻蝕電鏡（FF-TEM）等方法，研究了由Bacillus subtilis HSO121所產(chǎn)生的一組表面活性素的膠束化行為。通過對(duì)表面活性素溶液表面張力、表面活性素對(duì)水/正己烷界面張力的影響、表面活性素膠束微極性以及膠束粒徑和形態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)隨著表面活性素脂肪鏈長(zhǎng)度的增加，其表界面活性增強(qiáng)，溶液中趨向于形成更大的聚集體。

1引言

表面活性素（surfactin）是脂肽家族中一類具有代表性的生物表面活性劑。脂肽是由微生物在細(xì)胞表面或者由胞外分泌產(chǎn)生的一類由脂肪酸和肽組成的具有兩親結(jié)構(gòu)的化合物，是優(yōu)良的生物表面活性劑。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生的脂肽主要有表面活性素（surfactin）、地衣素（lichenysin）、伊枯草素（iturins）和豐原素（fengycin）等。表面活性素在1968年由Arima等1鑒定命名，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由Kakinuma等確定為含有7個(gè)α-氨基酸和β-羥基脂肪酸構(gòu)成的環(huán)狀脂肽類化合物。表面活性素可以在1×10-5mol·L-1濃度時(shí)，將水的表面張力由72 mN·m-1降低到27 mN·m-1,是表面活性最強(qiáng)的一類脂肽。另外表面活性素還表現(xiàn)出特殊的生物活性，如抗病毒、抗腫瘤、抗真菌、抗HIV和溶血等。表面活性素的這些表面和生物活性與它在水溶液中的物理化學(xué)性質(zhì)有著密切的關(guān)系，因此研究表面活性素溶液的性質(zhì)以及膠束化過程對(duì)于進(jìn)一步探索表面活性素的生物物理活性以及拓展其在化學(xué)工業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要的意義。

表面活性素的自身結(jié)構(gòu)，脂肪鏈和氨基酸部分的不同，對(duì)表面活性素的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。Gallet等14用分子模擬的方法研究了脂肪鏈長(zhǎng)度為13、14、15的表面活性素同系物在親水/親油界面上的不同構(gòu)型。Razafindralambo等用動(dòng)態(tài)表面張力法研究了脂肪鏈長(zhǎng)為13、14、15的表面活性素，發(fā)現(xiàn)隨著鏈長(zhǎng)的增加，動(dòng)態(tài)界面張力降低得更快。Song等用LB膜技術(shù)研究了烴鏈長(zhǎng)度對(duì)表面活性素界面形態(tài)的影響。Deleu等計(jì)算模擬了表面活性素和生物膜的作用，Eeman等研究了烴鏈長(zhǎng)度為13、14、15的環(huán)狀表面活性素以及烴鏈長(zhǎng)為15的直鏈表面活性素，都發(fā)現(xiàn)鏈長(zhǎng)的增加大大加強(qiáng)了表面活性素的表面活性，同時(shí)也影響著表面活性素和磷脂膜的相互作用。因此系統(tǒng)研究表面活性素分子結(jié)構(gòu)對(duì)其溶液性質(zhì)的影響，對(duì)表面活性素的化學(xué)和生物應(yīng)用都有一定的指導(dǎo)意義。

目前，對(duì)表面活性素溶液性質(zhì)的研究已有一些報(bào)道，但是基于分離純化技術(shù)的限制，大多數(shù)研究都是針對(duì)表面活性素同系物及其類似物的混合體系。這樣得到的結(jié)果難以準(zhǔn)確地表征表面活性素膠束化過程以及表面活性素溶液體系的各個(gè)參數(shù)，而且各個(gè)研究結(jié)果之間差異較大，結(jié)果不穩(wěn)定。本文由一株枯草芽孢桿菌HSO121出發(fā)，發(fā)酵培養(yǎng)及分離純化得到了5種主要表面活性素，通過表面張力、界面張力、熒光法、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和冷凍刻蝕電鏡（FF-TEM）對(duì)不同結(jié)構(gòu)的表面活性素溶液膠束化行為比較，得到表面活性素結(jié)構(gòu)差異對(duì)其溶液性質(zhì)和膠束化行為的影響規(guī)律。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1表面活性素的制備以及分離純化

實(shí)驗(yàn)所用的表面活性素樣品由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis HSO121培養(yǎng)產(chǎn)生。表面活性素粗提物用常壓反相柱（YMC ODS C18柱，Φ3.0 cm×10 cm,50μm）純化，去除色素。然后再由高效液相色譜（JASCO LC-2000,日本，HIQ sil C18W柱，Φ21.2 mm×250 mm,5μm），采用甲醇、水體系進(jìn)一步分離，得到各個(gè)表面活性素的組分，如圖1所示。

圖1表面活性素的分析型高效液相色譜圖

得到的脂肽先由氨基酸自動(dòng)分析儀獲得脂肽的氨基酸組成，然后用電噴霧四極桿~飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ESI Q-TOF MS/MS）和氣相色譜/質(zhì)譜連用（GC/MS）對(duì)脂肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

實(shí)驗(yàn)所用的表面活性素樣品結(jié)構(gòu)如圖2所示，脂肪酸鏈碳數(shù)分別為12、13、14、15、16。

2.2試劑

KCl,分析純，上海凌峰試劑有限公司；正己烷，分析純，上海菲達(dá)工程有限公司；使用0.05 mol·L-1,pH為8.5的Tris（Gene-Tech,純度＞99.95%）緩沖溶液；水為二次重蒸水。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1表面張力的測(cè)定

配置一系列濃度的表面活性素水溶液，0.05 mol·L-1Tris緩沖液，pH 8.5,25°C,用表/界面張力儀及動(dòng)態(tài)接觸角分析系統(tǒng)DCA315（Thermo Cahn,美國(guó)）測(cè)定其表面張力。

2.3.2界面張力測(cè)定

固定表面活性素濃度為4×10-5mol·L-1,用旋滴界面張力儀TX-550A型（芬蘭Kibron）測(cè)定了各個(gè)不同結(jié)構(gòu)的表面活性素對(duì)于水和正己烷的油水界面張力的影響。由TX-550A旋滴界面張力儀測(cè)得表面活性素水溶液中正己烷液滴的長(zhǎng)度L（cm）和寬度D（cm），計(jì)算得到界面張力。當(dāng)L/D≥4時(shí)，可根據(jù)式（1）計(jì)算液液界面張力：

圖2表面活性素結(jié)構(gòu)圖

式中γ為界面張力（mN·m-1），Δρ為兩相密度差（g·cm-3），Z為儀器上顯示的旋轉(zhuǎn)周期（ms·2π-1），K為常數(shù)0.3817.當(dāng)L/D＜4時(shí)，可根據(jù)式（2）計(jì)算：

式中f為校正參數(shù)，由不同的L/D值對(duì)應(yīng)得到。

2.3.3熒光法

表面活性素溶液的膠束微環(huán)境性質(zhì)由熒光分光光度計(jì)F-4500（Hitachi,日本）測(cè)定，采用芘（Sigma-Aldrich,99%（w））作為熒光探針。在激發(fā)光波長(zhǎng)為335 nm時(shí)，芘的熒光發(fā)射光譜在350-500 nm有5個(gè)特征峰，其中第一峰的熒光強(qiáng)度I1在極性溶劑中呈現(xiàn)出較大的增加，第三峰的熒光強(qiáng)度I3在非極性溶劑中較強(qiáng)，其強(qiáng)度隨條件變化不大，因此I1與I3之比值強(qiáng)烈依賴于環(huán)境極性。23測(cè)定芘在不同結(jié)構(gòu)表面活性素溶液（4×10-5mol·L-1）的熒光光譜，研究表面活性素結(jié)構(gòu)對(duì)其膠束微環(huán)境性質(zhì)的影響。

2.3.4動(dòng)態(tài)光散射

通過激光粒度儀Nano-ZS（Malvern,英國(guó)）測(cè)定了不同結(jié)構(gòu)表面活性素溶液中膠束粒徑的分布，樣品槽溫度恒定在25°C,表面活性素濃度為4×10-5mol·L-1.

2.3.5冷凍刻蝕電鏡

將樣品滴入樣品杯內(nèi)并迅速投入液氮（約77 K）中冷凍固定。在液氮環(huán)境下，樣品杯轉(zhuǎn)移到樣品座上，然后送入冷凍蝕刻儀BALZERS BAF-400D（Bal-tec,列支敦士登）的真空腔中（真空腔中的樣品臺(tái)及冷刀預(yù)冷到約100 K）。取出樣品桿，抽真空。等到系統(tǒng)壓力小于1×10-9Pa時(shí)，將樣品斷裂。以45°角向樣品斷裂面噴鍍厚約2 nm的鉑，然后以垂直方向噴鍍1-20 nm的碳層。取出樣品，重蒸水漂洗，用銅網(wǎng)將復(fù)型撈起，晾干后，用透射電子顯微鏡JEM-1400（JEOL,日本）觀察。

圖3不同鏈長(zhǎng)表面活性素溶液的表面張力圖